磷酸化蛋白WB檢測步驟及注意事項
發(fā)布時(shí)間：
2023-04-27 16:57
一、操作步驟
- 蛋白提?。ㄙN壁細胞）：將細胞培養板從CO2培養箱中取出棄去培養基，用PBS清洗一遍。將培養板放置在冰上，吸取事先配制好的western 及IP細胞裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑（western 及IP細胞裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑體積比為 1000∶10∶10）加入到培養板中，每孔200µl。加入后立馬用細胞刮板將細胞刮下，待細胞全部刮下后收集到1.5ml EP管中，置冰上用細胞破碎儀進(jìn)行破碎2min。破碎完成后進(jìn)行離心（12000 rpm、4℃、3min），最后收集上清進(jìn)行變性，-20℃備用。
- 蛋白定量（濃度測定）：用BCA法檢測蛋白濃度根據BCA蛋白試劑盒說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行操作，然后在酶標儀上測其吸光度。根據吸光度值制作標準曲線(xiàn)，算出蛋白濃度以及上樣體積。
- 配膠：根據目的蛋白分子量大小選擇合適的分離膠。
- 電泳：濃縮膠（80V 30min）、分離膠（120V 90min）。
- 轉膜：膠、膜、濾紙、順序是：三層濾紙、膠、膜、三層濾紙，電流：252mA 時(shí)間：90min。
- 封閉：用4%BSA封閉60min。
- 孵育抗體：一抗孵育過(guò)夜、然后用TBST清洗三次每次5分鐘，二抗孵育60min。
- 顯影：配制顯影液然后將所有切割的膜放入顯影液中，待膜完全浸濕后取出放入顯影儀中拼湊起來(lái)，最后顯影。
二、注意事項
- 蛋白提取全程在冰上進(jìn)行。
在提取蛋白過(guò)程中很多實(shí)驗人員在提取前半段通常沒(méi)有在冰上操作，這是導致蛋白變性或降解的重要原因之一，溫度過(guò)高會(huì )導致蛋白質(zhì)變性，因此在提取過(guò)程中都應在冰上進(jìn)行。
- 磷酸酶抑制劑嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作。
不同公司磷酸酶抑制劑的用量有差異，加入量太少則導致蛋白去磷酸化，從而提取不到磷酸化蛋白。
- 封閉液用4%BSA。
對于非磷酸化蛋白常用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，而磷酸化蛋白則不能，因奶粉中含有酪蛋白（磷酸化蛋白）能與抗體非特異性結合使條帶背景變臟。
- 二抗孵育時(shí)間為1小時(shí)。
封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )掩蓋表面抗原阻止抗體結合。
- 孵育抗體結束后每次清洗時(shí)間為5min。
清洗時(shí)間過(guò)長(cháng)導致信號減弱（抗體被洗脫）。
- 曝光時(shí)間不宜太長(cháng)或太短。
磷酸化蛋白檢測時(shí)背景往往比較深，所以曝光或壓片時(shí)間要適當,不能太長(cháng)或過(guò)短，太長(cháng)則背景太深蓋住了目的條帶,時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺。
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